原创 Cell Press 细胞科学
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2023年10月6日，澳门大学中华医研究院王瑞兵教授团队以“A as a decoy to treat ”为题，在Cell Press细胞出版社期刊上发表最新成果。研究团队提出胞内胶凝策略用于构建巨噬细胞海绵，阐明其作为中和治疗试剂用于抗细菌感染性疾病的作用机制，并进一步对巨噬细胞进行细菌诱导前处理，增强巨噬细胞海绵中和疗效，为新型广谱型抗菌治疗提供了新的思路。
人类的许多疾病都是由细菌感染引起的，如败血症、细菌性皮肤感染和各种细菌性呼吸道感染等，大多数都可以用抗生素进行治疗。然而，随着抗生素耐药菌株的出现，抗生素的疗效减弱。此外，传统的抗感染治疗总是注重细菌的杀灭，而常常忽视内毒素的清除。实际上，革兰氏阴性菌在细胞生长、裂解或抗生素治疗过程中释放的内毒素，是引起发热、中风、器官衰竭甚至死亡的关键原因。用抗内毒素抗体和内毒素中和蛋白隔离和中和循环内毒素是关键的治疗选择。因此，越来越多的中和治疗药物包括抗内毒素抗体和内毒素中和蛋白用于中和体内的内毒素。虽然，所有内毒素都有一个共同的结构基元，但不同细菌种类的内毒素结构基序差异很大，这将降低现有内毒素中和剂的结合力和清除效率。
此外，中和治疗药物与宿主细胞在识别和结合有害细菌和内毒素方面存在竞争关系。为了提高抗细菌感染效率，需要具有高亲和力的中和治疗药物进行竞争性吸附和中和细菌和内毒素，有效预防或抑制宿主细胞感染。
鉴于此，澳门大学王瑞兵团队构建了具有完整膜结构的胞内凝胶巨噬细胞，即巨噬细胞海绵，通过受体-配体相互作用中和细菌和内毒素，缓解细菌感染症状。此外，研究团队还发现细菌感染的巨噬细胞可以上调细胞膜病原体相关受体，并增加降低细胞膜的电负性，经过胞内凝胶化后明显增强巨噬细胞海绵对细菌和内毒素的识别清除。
图 1. 经细菌感染预处理的巨噬细胞海绵抗细菌感染中和治疗示意图。
巨噬细胞海绵构建及内毒素中和作用
本研究的目的是开发一种广谱型中和试剂用于细菌感染性疾病的治疗。为了实现这一目标，我们首先将水凝胶的制备转移到细胞质中，采用低温冷冻-常温解冻方式使凝胶材料渗入胞内构建凝胶化巨噬细胞（巨噬细胞海绵），并确认其细胞形态与宿主巨噬细胞类似，证实其膜结构和膜蛋白与宿主巨噬细胞保持一致。在体外抗菌感染治疗方面，考察了其吸附清除细菌、内毒素和炎症因子的性能。
图 2. 巨噬细胞海绵维持完整细胞形态和膜蛋白结构，并有效中和内毒素和炎症因子。
细菌诱导预处理增强巨噬细胞海绵细菌捕获能力
在胞内胶凝前，对巨噬细胞进行细菌诱导处理，分析其细胞膜表面病原体相关蛋白受体表达的变化，测定其细胞膜电位。采用扫描电镜分析巨噬细胞海绵和细菌的表面吸附情况，并利用共聚焦显微镜验证巨噬细胞海绵对细菌的静态捕获性能，测定细菌清除效率。为模拟血流情况的细菌捕获效果，采用微流控芯片技术证实巨噬细胞海绵对细菌的动态捕获性能，并测定细菌清除效率。证实经细菌诱导预处理的巨噬细胞海绵对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均显示出较强的静态和动态捕获能力。
图3. 经细菌预处理的巨噬细胞海绵高效捕获革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。
抗败血症和细菌伤口感染治疗
在败血症小鼠模型中，经细菌诱导处理的巨噬细胞海绵可提高小鼠存活率，肾脏和肝脏中细菌数量显著降低，同时炎症细胞因子TNF-α水平也下降。这主要归因于巨噬细胞海绵表面TLR4-LPS结合作用，有利于吸附和清除大肠杆菌和促炎细胞因子。除全身细菌感染外，还评估了巨噬细胞海绵对细菌感染性伤口的治疗效果。与革兰氏阴性菌（大肠杆菌）诱导的脓毒症模型不同，这里给小鼠皮下接种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）。结果显示巨噬细胞海绵加速了伤口愈合过程。HE染色进一步证实，巨噬细胞海绵减少了创面皮肤中的炎症细胞浸润、成纤维细胞迁移和增殖。伤口皮肤中的细菌含量也降低至较低水平。值得注意的是，在大肠杆菌诱导的脓毒症模型中，经大肠杆菌预处理的巨噬细胞海绵在降低器官细菌数量和全身炎症水平方面，表现出比经金葡菌预处理的巨噬细胞海绵更高的效率，而在鼠感染金黄色葡萄球菌伤口模型中，经金葡菌预处理的巨噬细胞海绵对伤口愈合表现出更好的治疗效果。
图 4. 经细菌诱导预处理的巨噬细胞海绵用于小鼠败血症和细菌伤口感染的治疗效果。
抗细菌性肺炎靶向治疗
凝胶化巨噬细胞与LPS诱导的炎性肺泡细胞共孵育，利用共聚焦显微镜观察其特异性吸附结合情况。采取LPS雾化吸入法构建小鼠急性肺炎模型，经尾静脉给予荧光标记的凝胶化巨噬细胞，利用共聚焦荧光成像分析心、肝、脾、肺、肾的荧光强度分布，进一步开展肺组织切片荧光成像，分析凝胶化巨噬细胞在肺组织中的增强渗透情况。小鼠经过巨噬细胞海绵治疗后，分析肺组织干湿比，利用试剂盒测定肺组织MPO和MDA含量，开展肺组织病理切片分析（HE染色和HO-1染色），检测肺灌洗液和血清的炎症因子水平（TNF-α和IL-1β），开展肺组织中M1型巨噬细胞的免疫荧光成像和流式细胞术定量分析。证实经细菌诱导预处理的巨噬细胞海绵可靶向富集到肺炎组织，并有效改善细菌感染性肺炎症状。
图 5. 经细菌诱导预处理的巨噬细胞海绵有效改善细菌感染性肺炎症状。
总结和展望
具有高稳定性的细胞内水凝胶可以作为理想的细胞质骨架来维持完整的细胞形态，通过巨噬细胞的胞内胶凝直接构建天然中和治疗药物（巨噬细胞海绵），用以吸附和清除细菌、内毒素和细胞因子。在治疗应用中，巨噬细胞海绵需要与宿主巨噬细胞竞争结合这些有害物质，但它们都具有相同的膜结构，对细菌和内毒素表现出相似的结合力，这可能导致有害物质的不完全中和。该研究发现对巨噬细胞进行细菌诱导预处理，可增强病原体相关受体（TLR4和LTR2）的产生，并减低巨噬细胞膜的电负性，从而增强巨噬细胞海绵对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、内毒素和炎症因子的结合力。因此，与宿主巨噬细胞相比，细菌诱导预处理使巨噬细胞海绵在中和细菌和内毒素方面表现出明显竞争优势，并且在败血症、伤口细菌感染和细菌性肺炎治疗中显示出增强疗效。这项研究通过巨噬细胞的细菌诱导预处理和随后的胞内胶凝过程构建巨噬细胞海绵平台，可以为广谱细菌感染治疗提供全面且有效的中和试剂。
相关论文信息
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▌论文标题：
A as a decoy to treat
▌论文网址：
(23)00462-9
▌DOI：
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