一种花叶芋体细胞无性系变异的选育方法
【技术领域】
[0001]本发明属于花卉遗传育种技术领域，具体涉及一种花叶芋体细胞无性系变异的选育方法。
【背景技术】
[0002]花叶芋( )为天南星科多年生草本，原产于南美热带地区，叶色变化非常丰富，具有红色、粉色、白色、黄色、紫色等，色彩鲜艳而独特，深受人们的喜爱，在西方国家广泛应用于庭院和园林造景，还可用作盆栽和切叶生产，是重要的彩色观叶植物。
[0003]体细胞无性系变异( )泛指在植物细胞、组织和器官培养过程中产生的遗传变异或表现遗传学变异。利用该方法能够获得很多具有经济价值的变异性状，如抗病性、矮化、抗逆性和丰产性等，现已育出许多优质农作物和花卉等新品种。举例来说，隶属于天南星科的合果芋属植物()，以白蝴蝶合果芋为亲本，通过该方法选育出22个新品种。无性系变异选育是合果芋属培育新品种最为重要的选育方法，但合果芋变异单株选择主要采用人工选择的方法，获得的部分变异单株仍然存在性状遗传不稳定的问题。
[0004]目前花叶芋育种主要采用常规的杂交育种方法，存在育种周期较长，进程慢等问题，其体细胞无性系变异选育的研究才刚刚起步，在国内还没有相关的文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明是对体细胞无性系变异单株选择的工艺流程进行了改进，并针对花叶芋传统杂交育种存在周期长、进程慢等问题，提供一种花叶芋体细胞无性系变异选育的新方法，它能有效获得可以稳定遗传的优良新品种，并缩短育种年限。
[0006]为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下:
一种花叶芋体细胞无性系变异选育方法的培养基，由以下三部分组成:
1)诱导培养基:在MS培养基的基础上，添加0.5?2mg/L的6-BA、0.1?2mg/L的2，4_D、20?40g/L鹿糖和6?8g/L卡拉胶，pH5.6?6.0 ；
2)分化培养基:在MS培养基的基础上，添加I?3mg/L的6-BA、0.1?^NAA、20?40g/L鹿糖和6?8g/L卡拉胶，pH5.6?6.0 ；
3)生根壮苗培养基:在MS培养基的基础上，添加0.1?lmg/L的NAA、20?40g/L蔗糖和6?8g/L卡拉胶，pH5.6?6.0。
[0007]优选的，所述培养基由以下三部分组成:
1)诱导培养基:在MS培养基的基础上，添加0.5?2mg/L的6-BA、0.1?lmg/L的2，4_D、25?35g/L鹿糖和6?8g/L卡拉胶，pH5.8?6.0 ；
2)分化培养基:在MS培养基的基础上，添加I?2mg/L的6-BA、0.1?0.5mg/L的NAA、25?35g/L鹿糖和6?8g/L卡拉胶，pH5.8?6.0 ； 3)生根壮苗培养基:在MS培养基的基础上，添加0.1?0.5mg/L的NAA、25?35g/L蔗糖和6?8g/L卡拉胶，pH5.8?6.0。
[0008]—种花叶芋体细胞无性系变异的选育方法，包括下列步骤:
(1)培养基的配制:配置上述所述的培养基；
(2)外植体的选择和消毒处理:选取尚未展开的幼嫩叶片和叶柄为外植体，对其进行消毒处理；
(3)愈伤组织诱导培养:将消毒处理后的叶片切成I?2cm小段，接种于诱导培养基中黑暗培养；
(4)分化培养:将诱导产生的愈伤组织转接至分化培养基中，诱导分化出芽；
(5)生根壮苗培养:当芽长至1.8?2.5cm时，切分成小块，转接到生根壮苗培养基中诱导生根，长成幼苗；
(6)移栽炼苗:当幼苗长至4?5cm时，将培养瓶移至温室大棚中炼苗5?8天后，将试管苗取出，冲洗干净，栽种于穴盘中；待植株长到有3-4片叶时，将苗移栽上盆；
(7)变异单株的选择:从亲本的无性系后代群体中，筛选出性状独特的变异单株，并采用流式细胞仪对变异单株的细胞DNA含量进行测定和分析，变异单株的峰值位置为亲本的1.6?2.2倍，确定变异单株由亲本染色体加倍引起，能够稳定遗传，为花叶芋的优选单株；
(8)优选单株的无性系后代群体的建立:取优选单株的幼嫩叶片为外植体，进行组培扩繁，并以亲本为对照，对植株生长、叶片、块茎和生长势等主要性状，进行多年多点试验调查，验证优选单株后代群体的特异性、一致性和稳定性；
(9)新品种的培育:经品种比较试验调查，后代群体植株具有独特的观赏性状，形成性状和表现一致的群体，符合育种目标，定为新品种。
[0009]优选的，步骤(2)中的外植体的消毒处理步骤为70%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗2次，0.1%升萊浸泡8-10min，最后用无菌水漂洗5次。
[0010]优选的，步骤(4)中分化培养的条件为光照强度为800?，光照时间为每天11?13小时。
[0011]优选的，步骤(6)中穴盘中的基质为高要泥炭:珍珠岩的质量比为3:1的混合基质。
[0012]优选的，步骤(7)中筛选变异单株的标准包括:叶片变圆形、质地变硬、叶柄变粗壮和/或株型变矮。
[0013]优选的，步骤(7)中变异单株采用流式细胞仪对变异单株的细胞DNA含量进行测定和分析，变异单株的峰值位置为亲本的1.8?2倍，确定为花叶芋的优选单株。
[00M] 优选的，花叶芋品种选自‘玫瑰花蕾’(‘Rose bud ’)、‘福利达’(‘ Fr ，)、‘白鹭’ (‘’ )、‘凯瑟琳’ (’ ) ‘迷你白，(‘Mini White，)、‘金哲兰’ (' )。
[0015]优选的，花叶芋品种为‘玫瑰花蕾，或‘福利达，。
[0016]本发明的有益效果是:
(I)对现有无性系变异单株选育技术进行改进，变异单株的稳定性明显提高:
以往报道的天南星科植物无性系变异单株选育方法，是在变异单株选择时仅采用人工选择的方法，获得的变异单株存在不稳定性。本发明在人工选择的基础上，结合流式细胞仪检测方法，能够快速获得稳定遗传的优选变异单株，从而大大提高了变异单株的稳定性，该方法是一个稳定、速度快且效率高的无性系变异选育的新方法。
[0017](2)缩短育种年限，提高育种效率:
本发明方法选育周期为5?6年，其中包括对亲本进行组织培养至出苗需I年;亲本瓶苗移栽种植，进行变异单株选择，并利用流式细胞仪对变异单株的细胞DNA含量的测定和分析，确定优选单株需I年;对优选单株进行组织培养至出苗需I年;变异单株瓶苗移栽种植，进行多年多点品种试验调查，最终选育出新品种需2?3年。花叶芋常规杂交育种周期为7?8年，本发明方法大约缩短了 2年。
[0018](3)能有效获得综合性状比亲本优良的新品种:
本发明对传统品种进行改良，培育出的新品种株型变矮，叶片变圆形，叶色更鲜艳，叶片质地更硬，叶柄更粗壮，综合性状明显优于亲本。
【附图说明】
[0019]图1为亲本‘玫瑰花蕾’(左)与变异单株‘C2-0’(右)植株比较；
图2为亲本‘玫瑰花蕾’与变异单株‘C2-0 ’相对核DNA含量对比图；
图3为亲本‘玫瑰花蕾，与变异单株‘ C2-0，花叶芋的单株性状表现对比图；
图4为亲本‘玫瑰花蕾，与变异单株‘ C2-0，花叶芋的群体性状表现对比图；
图5为亲本‘福利达，与变异单株‘ C3-0，相对核DNA含量对比图；
图6为亲本‘福利达，与变异单株‘ C3-0，花叶芋的叶片对比图；
图7为亲本‘福利达，与变异单株‘ C3-0，花叶芋的单株性状表现对比图；
图8为亲本‘福利达，与变异单株‘ C3-0，花叶芋的群体性状表现对比图。
【具体实施方式】
[0020]英文缩略词:
6-苄基氨基腺嘌呤为6-BA、2，4-二氯苯氧乙酸为2，4-D。
[0021]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0022]实施例1
以花叶芋品种‘玫瑰花蕾’为亲本材料，获得变异单株C2-0新品种的选育方法。
[0023]该方法按以下步骤进行:
(1)培养基的配制:
培养基由以下三部分组成:
a)诱导培养基:在MS培养基的基础上，添加0.5?2mg/L的6-BA、0.1?2mg/L的2，4-D、20?40g/L鹿糖和6?8g/L卡拉胶，pH5.6?6.0 ；
b)分化培养基:在MS培养基的基础上，添加I?3mg/L的6-BA、0.1?^NAA、20?40g/L鹿糖和6?8g/L卡拉胶，pH5.6?6.0 ；
c)生根壮苗培养基:在MS培养基的基础上，添加0.1?lmg/L的NAA、20?40g/L蔗糖和6?8g/L卡拉胶，pH5.6?6.0 ；
(2)外植体的选择和消毒处理:选取亲本‘玫瑰花蕾’尚未展开的幼嫩叶片为外植体，用70%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗2次，0.1%升汞浸泡8?lOmin，最后用无菌水漂洗5次； (3)愈伤组织诱导培养:将消毒处理的叶片用刀片切成I?2cm小段，接种于诱导培养基中黑暗培养；
(4)分化培养:将诱导产生的愈伤组织转接到分化培养基中，于光照条件下培养，光照强度为800?，每天光照时间12小时，诱导分化出芽；
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